研究背景

大多数胰腺癌患者死于局部复发或远处转移。神经周围浸润（PNI）是肿瘤扩散的一种典型途径，发生率为70%-100%。PNI是根治性切除后局部复发的主要原因，也是远处转移的始发步骤。胰腺癌最有效的根治性治疗仍然是R0切除。目前争论的焦点是如何确定术中的负切缘。

在胰腺癌切缘阴性的患者中，精确的胰周神经丛解剖可能会提高生存率并降低复发率。传统的成像和可视化技术无法识别周围胰腺神经丛的阴性边界。近红外荧光成像（NIRF）成像由于能够在术中定位胰腺肿瘤病变和肿瘤的阴性边缘，被用于胰腺癌手术导航中。吲哚菁绿（ICG）是一种菁类近红外染料，已被FDA批准用于临床。ICG具有亲脂性，但稳定性较差，缺乏靶向性，肿瘤中滞留性差。

GAP-43是一种神经重塑的标志性蛋白，在正常成年动物中低水平表达，与多种癌症的进展和转移有关，包括肺癌、甲状腺癌等。最近的研究发现，GAP-43在胰腺癌中的表达是正常胰腺组织的8倍，在良性肿瘤中不表达。此外，文献显示GAP-43只在PNI中表达，而在胰腺癌细胞中不表达。类似地，一项新的蛋白质组学研究发现，GAP-43在PNI组中含量明显更丰富。因此，研究人员有充分的理由相信GAP-43是一个特异的分子成像靶点。

基于此，南方医科大学珠江医院范应方教授团队，以GAP-43作为靶点，高度特异性结合肽抗体来修饰ICG，制备一种用于PNI术中成像的近红外荧光（NIRF）探针。同时用聚乙二醇修饰形成脂质体以增加其亲水性和稳定性。该探针在临床前模型中有效地可视化了胰腺癌中的PNI病变，为NIRF引导的胰腺手术开辟了新的可能性，特别是对于PNI患者。

胰腺癌组织中靶向PNI的GAP-43Ra-ICG-PEG的实时可视化

研究结果

首先，研究人员通过分析TCGA和GEO数据库，发现GAP-43在胰腺癌组织中大量表达，尤其是在PNI组织中，并且其高表达与不良预后显著相关。然后通过分析胰腺癌的临床样本进一步证实了这一结果。这一发现与几项研究一致，表明GAP-43是一个理想的PNI标记，因此是构建PNI探针的理想候选者。

胰腺癌样本中GAP-43的表达图

胰腺癌样本中GAP-43表达的验证图

研究团队合成并表征了GAP-43Ra-ICG-PEG探针，然后验证探针的体外摄取。

将生物学上与神经细胞相似的分化良好的PC12细胞与肿瘤细胞进行体外共培养，以模拟肿瘤细胞的神经侵袭。PC12与探针孵育后显示出最高强度的荧光信号，表明在体外模型中被肿瘤侵袭的神经细胞对GAP-43Ra-ICG-PEG探针表现出特异性的高亲和力。IHC显示，与肿瘤细胞共培养后，GAP-43在PC12细胞中高表达。

体外验证探针的靶向性和毒性图

（1）建立坐骨神经浸润模型以进行体内验证。时间强度和TBR（肿瘤背景比）曲线表明在体内，PNI对探针的特异性摄取。

PNI模型中探针的NIRF成像图

（2）此外，激光共聚焦显微镜最明显的发现是GAP-43Ra-ICG-PEG探针与受侵袭神经的神经元特异性蛋白S-100共定位，具有最强的荧光强度。据体外结果，IHC和WB分析显示GAP-43在肿瘤侵袭的神经中高度表达。

WB和IHC分析图

研究人员在PNI小鼠模型中使用GAP-43Ra-ICG-PEG探针进行手术导航，以验证其临床适用性。结果显示，仅通过肉眼进行“完全”切除容易遗漏一些微小病变。在对神经切除切缘的分析中，在神经残端发现了一些残留的肿瘤细胞。60%小鼠在神经切除边缘没有残余肿瘤细胞。

肉眼切除肿瘤和PNI病变图

为了进一步证明探针的临床应用潜力，在PNI小鼠模型中进行了临床实践中经常使用的手术荧光导航系统验证。正如预期的那样，手术荧光导航系统和小动物成像系统的时间荧光曲线趋势大致相同。此外，使用NIR FI手术导航系统切除肿瘤后，在周围的边缘组织中没有发现肿瘤。

具有NIR FI手术导航系统的小鼠PNI模型的示意图

研究人员构建神经损伤模型，以证明GAP-43Ra-ICG-PEG探针集中在肿瘤侵袭的神经中，而不是肿瘤本身。结果显示，随着时间的延长，在注射探针后的每个时间点，损伤神经的荧光信号显著高于对照探针组和正常神经组。排除干扰因素后，受损神经和正常神经的荧光比较显示，受损神经特异性摄取GAP43Ra-ICG-PEG探针。值得注意的是，IHC结果证实GAP-43在受损神经中高度表达。

坐骨神经损伤模型的荧光图像图

以上证据表明，GAP-43Ra-ICG-PEG探针可能具有临床实用性，可用于识别胰腺癌中的PNI，并在胰腺癌手术期间使用荧光导航实现R0切除，尤其是在PNI R0切除中。该研究的另一发现是，GAP-43Ra-ICG-PEG探针在物理损伤的神经上的荧光成像产生了优异的结果。这可能对各种外科手术中医源性神经损伤的诊断有所帮助。然而，这需要进一步的验证。

本研究中的GAP多克隆抗体由强耀生物提供。