1、蛋白质保存的挑战

无论是花费数月时间自行开发的蛋白，还是购买按毫克计价的商品化蛋白。在纯化获得蛋白到使用之前往往需要保存几天至几个月不等。如此珍贵的蛋白，一朝保存不慎，失了活性，时间没了事小；钱没了，延毕了可就事大了。

蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的大分子化合物，每个蛋白质分子都具有特异的三维结构,电荷分布,氨基酸残基,位点修饰等。这些特征决定了每个分子独特的生物学活性和理化性质，也导致其易受到物理（如温度、pH值）、化学（如氧化剂）以及生物因素（如酶解）的影响而发生变性或降解。因此，蛋白质保存要保证活性和完整性，防止变形及降解的发生。

2、影响蛋白质稳定性因素

蛋白质在制备、保存、使用过程中，可能会出现聚集、沉淀和变性等问题，这些问题通常是由以下因素引起的：

2.1 剧烈刺激

pH值变化，温度变化、反复冻融、搅拌（蛋白质暴露于空气-水界面）、过滤（蛋白质暴露于液体-固体界面），以上因素剧烈变化可能导致蛋白空间结构的变化，从而形成沉淀。

2.2氨基酸侧链变化

1、氧化：甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸等氨基酸残基容易发生氧化，导致蛋白质失活，一般加入一些稳定剂，如蔗糖，对天然状态压实，可以延缓暴露残疾的氧化率。

2、水解：天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺作用，以及肽主链的肽基团的切割，都会影响蛋白质的稳定性，造成蛋白功能改变。

3、保存原则

3.1减少蛋白酶影响

1、原因：蛋白酶能催化蛋白质和多肽水解，广泛存在，在开始制备蛋白时就需要考虑减少蛋白酶的影响。

2、建议：使用蛋白酶缺陷的菌株；在破菌纯化蛋白开始就需要加入蛋白酶抑制剂以减少胞内蛋白酶的影响；并且使用无污染的枪头，缓冲液等可减少来自其他微生物的蛋白酶的污染。此外，目的蛋白以包涵体形式存在时可降低蛋白酶的破坏作用。

3.2低温

1、原因：低温可以降低蛋白质分子的热运动，减少内部成键的断裂风险。同时，低温环境下微生物不易生长，蛋白酶活性也较低，有助于保持蛋白质的活性。

2、建议温度：短期保存（1周内）可在4°C下进行；长期保存（数月到数年）应在-20°C或-80°C下进行。

3.3分装

1、原因：蛋白有时需要冷冻保存，但使用时需要室温或更高温度，多次冻融会损伤蛋白质，导致其失活或变性。此外分装体积不宜过小，体积越小受蒸发和管壁吸附影响越大。

2、建议：将纯化后的蛋白质分成小份保存，一般建议50到100微升每管，可根据蛋白浓度和实验需求调整，最少不低于10微升，每次使用时仅解冻所需部分，冻融次数不要超过两次，实验剩余蛋白一般可暂存4℃冰箱不超过一周。

3.4浓度

1、原因：保持蛋白质浓度适中，过高会导致蛋白聚集沉淀，过低（<0.1mg/mL）会使蛋白特异性吸附在管壁上，影响后续实验。

2、建议：建议浓度为1 -10mg/mL。

3.5速冻/速融

1、原因：缓慢冷冻会使蛋白质暴露在高盐浓度或极端pH下，破坏其活性。解冻也需让蛋白快速恢复到适宜的盐浓度和pH条件下。

2、方法：使用液氮或干冰/乙醇/丙酮混合物进行速冻；解冻时可像复苏细胞一样在37℃温水中快速进行。

3.6添加剂

在选择添加剂时，一定要保证所加试剂不会影响到蛋白的活性。

1、缓冲液：

选择合适的缓冲液，一般要求PH在中性范围内，盐浓度在0-150mmol/L，比如50 mmol/L pH8.0的Tris-HCl或PBS。

2、保护剂：

甘油：10%-50%，防止蛋白质冷冻，不需要经历冻融。

叠氮化钠：0.02%-0.1%，防止细菌生长。但叠氮化钠会干扰某些抗体蛋白参与一些氨基反应，这时可利用0.01%的硫柳汞。在体内实验时，不可添加叠氮化钠和硫柳汞，通常采用过滤除菌。

PMSF：蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶降解。

DTT：还原剂，防止蛋白质氧化。

4、保存策略

4.1在液体状态下不冻结保存

温度控制：蛋白质一般在2-8℃进行短期保存，可维持其稳定性，减少聚集沉淀，但蛋白还是会缓慢的化学降解。

pH值调节：维持蛋白质在稳定的pH范围内，通常在5.5-7.5之间。

稳定剂：蛋白质去折叠的能力较强，加入非特异性稳定剂，如蔗糖（0.5M），对维持蛋白质的稳定性具有较好的效果。

添加剂：硫酸铵、甘氨酸、聚乙二醇、蔗糖等添加剂可以通过优先排阻的方法维持蛋白质的热力学稳定性，其中柠檬酸盐缓冲液（存在钙离子的情况下不能使用）效果最佳。

缓冲液：溶液中离子的电荷屏蔽降低了蛋白质分子间的电荷-电荷排斥作用，这些离子浓度的选择需要具体的实验优化。

4.2在冻结温度下保存

低温保存：对于-80℃和-20℃保存，首选-80℃。一方面低温可以较大程度降低蛋白降解速率；另一方面由于-20℃冰箱经常开关的特点，温度一般达不到-20℃，特别是靠门的地方，特别是在无霜冰箱中还会出现反复冻融的现象。而且，-20℃接近某些盐的共融点，在这个温度上下易造成晶体的反复冻融，引起蛋白质变性。

缓冲液选择：低温下的碱性盐结晶，而酸性盐仍然可溶，冷冻时磷酸盐缓冲液pH值下降很多，这会引起许多蛋白发生变性。应选择柠檬酸盐、Tris、组氨酸等缓冲液，以减少pH值变化。

保护剂：加入甘油、盐析盐、二糖（以上保护剂浓度高于0.3M）、表面活性剂（浓度低至0.1%）等保护剂，可以有效防止蛋白质变性和沉淀；加入百分之几BSA或聚合物也能够抑制冷冻引起的蛋白质去折叠；增加蛋白质的起始浓度，也增强在冻融过程中蛋白质制备物对损伤的耐受性。

4.3冻干保存

冻干是将溶剂或悬浮介质在低温下冷冻，然后将其由固态直接升华为气态的一种干燥方法。该方法能够很好地保持物质骨架的稳定性，并且在复融后也不改变。

冻干过程：冻干包括预冻结、升华干燥和解析干燥三个阶段。

稳定剂：冻干过程中添加必要的稳定剂以防止蛋白质的变性，其中添加非还原型的海藻糖和蔗糖（200-300mM）作为稳定剂对蛋白质保护最有效。避免使用还原型糖，如葡萄糖，麦芽糖，乳糖等，会引起美拉德（Maillard）反应降解蛋白质。目前，商业化的添加方法添加海藻糖5%，甘露醇5%，tween-80 0.01%。

缺点：冻干设备复杂且昂贵，通常作为最后的保存选择某些蛋白质无法复溶，冻干/复溶过程可能损伤蛋白质。

5、注意事项

SDS-PAGE检测：在发现蛋白活性丢失时，先进行SDS-PAGE跑胶，确认蛋白是否降解。

无菌操作：皮肤上的蛋白酶和其他化学物质可能污染蛋白样品，操作时戴手套，使用灭菌的小管保存蛋白质。

避免震荡：震荡产生的剪切力和气泡中的氧气可能导致蛋白质氧化，破坏其活性。

通过以上策略，可以有效地保持蛋白质的理化性质稳定，延长其保存时间。