生物合成法合成同位素标记多肽,主要依赖细胞或无细胞系统的代谢过程,将稳定同位素标记的氨基酸精准掺入多肽链中,具体过程如下:
1、培养基配置:在培养基中添加高丰度(>96%)的稳定同位素标记氨基酸,如¹⁵N-赖氨酸、¹³C-亮氨酸等。这些同位素标记氨基酸将作为细胞合成多肽的原料。
2、细胞培养:在适宜条件下(如温度、pH值、氧气浓度等)培养目标细胞(如酵母菌、哺乳动物细胞等),在细胞生长过程中,会利用培养基中的同位素标记氨基酸合成自身所需要的多肽和蛋白质。
3、多肽提取与纯化:裂解细胞,释放细胞内的多肽和蛋白质,通过色谱或者质谱技术纯化目标多肽,去除杂质和非标记多肽。
4、系统构建:将细胞提取物、能量供应体系(如ATP)、同位素标记氨基酸和目标多肽DNA模板混合,构建无细胞蛋白合成系统。
5、翻译反应:在适宜条件下启动翻译过程,利用细胞提取物中的核糖体,tRNA等翻译机制,将同位素标记氨基酸连接成多肽链。
6、纯化与鉴定:通过亲和富集或色谱技术纯化标记多肽,通过质谱确认标记效率和多肽结构正确性。
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